近日，南方科技大学生命科学学院化学生物学系助理教授闫凯歌团队在Nature Communications期刊发表了题为Molecular basis for the regulation of human phosphorylase kinase by phosphorylation and Ca2+的研究成果。研究团队利用近原子分辨率的冷冻电镜技术，解析了蛋白激酶PhK无活性和激活状态下的结构，结合生化实验揭示了其活性调控和底物结合的机制。
糖原是动物体内葡萄糖的储存形式，糖原磷酸化酶（GP）是催化糖原分解的限速酶，启动糖原分解成葡萄糖，用于维持机体血糖稳定和为多种细胞活动提供能量。磷酸化酶激酶（PhK）通过磷酸化GP将其从无活性的b形式转化为有活性的a形式，从而开启这一重要的生命过程。这种磷酸化介导调控机制的发现和PhK的鉴定是生物化学和细胞生物学的重要里程碑，其不仅为人类能量产生过程提供了重要的见解，而且还彻底改变了我们对细胞信号传导事件的认识。PhK是目前已知的最大和最复杂的蛋白激酶之一，它包含四个亚基：α, β, γ和δ，四个亚基组装成1.3 MDa的异源16聚体α4β4γ4δ4。PhK的活性受激素信号与神经信号的调节控制，当这些信号传递至PhK时，其α和β亚基会被一种依赖于cAMP的蛋白激酶A（即PKA）所磷酸化，从而促使PhK实现部分激活。另一方面，δ亚基作为钙调素Calmodulin（CaM）这一内源性分子，负责介导由神经元刺激引发的Ca2+对PhK活性的调节作用。值得注意的是，PhK的功能异常不仅与糖原累积症紧密相关，而且与某些癌症的发生也息息相关。解析磷酸化和钙离子状态下PhK的高分辨率结构，有利于理解激素信号与神经信号对于PhK的调控作用，将为基于PhK的葡萄糖调控以及糖原代谢相关疾病的治疗提供结构信息。
在本研究中，闫凯歌团队成功解析了PhK在无活性状态和磷酸化/Ca2+激活状态下的高分辨率冷冻电镜结构，通过这些结构研究，团队揭示了PhK复合物中四个亚基（αβγδ）的相互作用和相对位置。PhK复合物正面似展翅的蝴蝶，侧面视角则兼具酒杯状轮廓与长方体形态特征。其核心骨架由四个β亚基（β4）以D4对称方式形成稳定的中央枢纽；外周的αγδ异源三聚体则如同蝴蝶的翅膀，通过α亚基与中央骨架相连，这种分布方式使得催化亚基γ同时受到调节亚基α，β和δ的调控。
图1 PhK复合物的冷冻电镜结构
进一步的分析显示，PKA主要通过磷酸化α亚基的S1018和β亚基的S27和S700位氨基酸，使得四个原聚体向中心移动，从而破坏了催化亚基γ-N lobe的稳定性。Ca2+与δ亚基（CaM）结合，致使δ亚基沿γ-CBD区域滑动，破坏了γ-C lobe的稳定性。此外，研究团队通过交联质谱分析了PhK在无活性状态和激活状态下与底物的不同结合模式。在无活性状态下，底物与α和β亚基相互作用；磷酸化/Ca2+激活之后，促使δ亚基的CKD结构域稳定性降低，底物GP的靠近进一步诱导CKD结构域的翻转，暴露活性中心，从而发挥催化作用。本研究为PhK的调控机制提供了有价值的见解，从而为治疗PhK异常导致的糖原累积症提供了科学依据。
图2 PhK活性调控模型
南方科技大学为第一通讯单位。南科大研究助理教授马瑞芳、博士生杜博文和浙江大学博士生时晨为论文共同第一作者。闫凯歌助理教授和浙江大学王勇教授为论文共同通讯作者。南科大已毕业博士生王雷、博士生韩洁和硕士生官惠怡参与了该工作，南科大生科院曾福星助理教授对此项工作给予了大力协助。本研究得到了国家自然科学基金委、博士后科学基金委、广东省科学技术厅、深圳市科创局、南方科技大学高分辨生物电镜结构研究院、南方科技大学冷冻电镜中心、南方科技大学分析测试中心和国家蛋白质中心的资金和技术支持。
文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-025-58363-8
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